目的：探讨制药洁净区环境微生物菌种分布特征及风险识别价值。方法：采集A级至D级区空气、沉降菌、表面擦拭和人员样本160份，采用培养计数、MALDI-TOFMS鉴定、16SrRNA测序及耐药谱检测，按区域级别和样本类型分组，应用方差分析和聚类分析评价差异。结果：共检出环境菌株286株，革兰阳性菌占72.03%，优势菌为葡萄球菌属、微球菌属和芽孢杆菌属；D级区检出率显著高于A级区，表面样本菌种多样性高于空气样本；12.59%菌株存在多重耐药，聚类结果提示人员与表面污染具有同源关联。结论：本研究为制药环境微生物溯源与分级管控研究提供了多维检测新方法，可提升洁净区污染预警和质量风险管理水平。